Количество лейкоцитов в крови зависит как от скорости их образования, так и от мобилизации их из костного мозга, а также от их утилизации и миграции в ткани (в очаги повреждения), захвата легкими и селезенкой. На эти процессы, в свою очередь, влияет ряд физиологических факторов, и поэтому число лейкоцитов в крови здорового человека подвержено колебаниям: оно повышается к концу дня, при физической нагрузке, эмоциональном напряжении, приеме белковой пищи, резкой смене температуры окружающей среды.

Количественное определение лейкоцитов

Лейкоциты подсчитываются с использованием камеры Горяева и с помощью автоматических счетчиков.

Подсчет лейкоцитов с помощью камеры Горяева

При пробирочном методе взятия крови для подсчета лейкоцитов:

• в пробирку наливают 0,4 мл раствора 3–5% уксусной кислоты, подкрашенной метиленовой синью. Капиллярной пипеткой набирают из свежей капли 20 мкл крови (разведение в 20 раз), осторожно выдувают ее в пробирку с реактивом и ополаскивают пипетку. Смесь хорошо перемешивают;
• чистое и сухое покровное стекло притирают к камере так, чтобы в месте соприкосновения образовались радужные кольца;
• кровь, разведенную в пробирке, хорошо перемешивают. Концом круглой стеклянной палочки отбирают каплю крови и подносят к краю шлифованного стекла камеры;
• после заполнения камеры ее оставляют на 1 мин в покое для оседания лейкоцитов;
• считают лейкоциты при малом увеличении (объектив ×8 или ×9, окуляр ×10 или ×15) при затемненном поле зрения (при опущенном конденсоре или суженной диафрагме);
• для получения удовлетворительных результатов подсчитывают лейкоциты в 100 больших квадратах.

Зная объем большого квадрата и степень разведения крови, находят количество лейкоцитов в 1 мкл и 1 л крови. Сторона большого квадрата равна 1/5 мм, площадь - 1/25 мм2, объем пространства над этим квадратом - 1/250 мм3.

Формула для подсчета лейкоцитов:

где В - количество лейкоцитов в 100 больших квадратах;
П - степень разведения (20).

Количественное содержание лейкоцитов

Норма: 4,0–9,0 × 10 9 /Л

Увеличение количества лейкоцитов выше 9,0 × 10 9 /л называется
лейкоцитозом, уменьшение их числа ниже 4,0 × 10 9 /л - лейкопенией. Однако даже 3,5 × 10 9 в 1 л лейкоцитов для ряда лиц может являться нормой. По данным литературы, у таких людей повышена иммунная сопротивляемость и они реже болеют, что, по-видимому, объясняется необходимостью для осуществления иммунных реакций наличия резерва лейкоцитов в тканях, где их в 50–60 раз больше, чем в кровяном русле. Очевидно, именно у здоровых лиц с низким содержанием лейкоцитов в периферической крови соответственно увеличены резервы их в тканях. Объясняют этот феномен наследственно-семейным характером или повышением влияния парасимпатической нервной системы.

Лейкопения может быть функциональной и органической.
Функциональная лейкопения связана с нарушением регуляции кроветворения и наблюдается:

• при некоторых бактериальных и вирусных инфекциях (брюшной тиф, грипп, оспа, краснуха, болезнь Боткина, корь);
• при действии лекарственных препаратов (сульфаниламидов, анальгетиков, противосудорожных, антитиреоидных, цитостатических и других препаратов);
• при мышечной работе, введении чужеродного белка, нервных и температурных влияниях, голодании, гипотонических состояниях;
• ложная лейкоцитопения может быть связана с агрегацией лейкоцитов во время длительного хранения крови при комнатной температуре (более 4 ч).

Органическая лейкопения, возникающая в результате аплазии костного мозга и замещения его жировой тканью, бывает при:

• апластической анемии;
• агранулоцитозе;
• лейкопенической форме лейкоза;
• некоторых формах лимфогранулематоза;
• ионизирующем облучении;
• гиперспленизме (первичном и вторичном);
• коллагенозах.

Лейкоцитоз

Лейкоцитоз - это реакция кроветворной системы на воздействие
экзогенных и эндогенных факторов. Различают физиологический и патологический лейкоцитоз.

Физиологический лейкоцитоз бывает:

• пищеварительный - после приема пищи, в особенности богатой белками; число лейкоцитов не превышает 10,0–12,0 × 10 9 /л и через 3–4 часа возвращается к норме;
• при эмоциональном напряжении (выделение адреналина), тяжелой физической нагрузке, охлаждении, чрезмерном пребывании на солнце (солнечные ожоги), введении ряда гормонов (катехоламинов, глюкокортикостероидов и др.), во второй половине беременности, во время менструаций и обусловлен неравномерным распределением лейкоцитов в кровяном русле.

Патологический лейкоцитоз делится на абсолютный и относительный.

Абсолютный лейкоцитоз - повышение числа лейкоцитов в крови до нескольких сотен тысяч (100,0–600,0 × 10 9 /л и более).

• Наиболее часто наблюдается при лейкозах: при хроническом лейкозе - в 98–100 % случаев, при острых лейкозах - в 50–60 %. Изменение соотношения клеток лейкоцитарного ряда в пунктате костного мозга и в крови служит основой диагностики лейкозов.

Относительный лейкоцитоз наблюдается:

• при острых воспалительных и инфекционных процессах, исключение составляют брюшной тиф, грипп, оспа, краснуха, бо лезнь Боткина, корь. Наибольший лейкоцитоз (до 70,0–80,0 × 10 9 /л) отмечается при сепсисе;
• под влиянием токсических веществ (ядов насекомых, эндотоксинов), ионизирующей радиации (сразу после облучения);
• в результате действия кортикостероидов, адреналина, гистамина, ацетилхолина, препаратов наперстянки;
• при распаде ткани (некрозе), инфаркте миокарда, тромбозе периферических артерий с развитием гангрены, ожогах, экссудативном плеврите, перикардите, уремии, печеночной коме;
• значительных кровопотерях при ранениях, внутренних, гинекологических и других кровотечениях.

Повышение числа лейкоцитов при инфекционных заболеваниях в большинстве случаев сопровождается сдвигом лейкоцитарной формулы влево

Устройство представлено толстым стеклом, внутри которого имеется углубление. На нем нанесена сетка, видимая только под микроскопом, по которой врач-лаборант подсчитывает клетки. Сверху камеры помещаются предметные стекла таким образом, чтобы исследуемый материал сдавливался с двух сторон.

Камера Горяева производится в 2 вариантах:

• двухсеточная (состоит из 2 камер);
• четырехсеточная (состоит из 4 камер).

Цена приспособления зависит от его качества. Производитель должен отшлифовать стекло, правильно нанести сетку с помощью лазера или вакуумного напыления.

Сетка Горяева состоит из 225 квадратов. Они бывают большими и малыми. Врач перемещает микроскоп над ними слева направо, вниз, затем справа налево, пока все поля не закончатся.

Обслуживание камеры Горяева

Чтобы приспособление показывало верные результаты, за ним необходимо ухаживать. Камеру необходимо тщательно протирать перед применением. Для этого используют бинт, который смачивают в спирте. Стерилизующая жидкость должна быть качественная, чтобы на поверхности стекла не осталось осадка. Стекло готово к работе, если на нем появились радужные кольца на обеих поверхностях.

Важно! Нельзя использовать для протирания камеры вату, так как она содержит волокна, которые могут остаться на поверхности стекла, что затруднит исследование.

Камера Горяева идёт в стандартной комплектации, с покровными стеклами. Если они отсутствуют или сломались, возможно использование обычных стекол, соответствующих по размеру.

Во время работы с камерой и предметными стеклами врач-лаборант должен надевать перчатки. Это предотвращает попадание отпечатков пальцев, которые будут мешать в работе с микроскопом.

После завершения работы камера должна быть продезинфицирована. Для этого ее погружают целиком в раствор этилового спирта. Время дезинфекции составляет 30 минут. Если используется другой стерилизатор, время удлиняется до 1 часа. После завершения данного этапа устройство обрабатывают водой и протирают насухо.

Методика подсчета лейкоцитов в крови в камере Горяева

Для подсчета лейкоцитов с помощью камеры Горяева необходимо подготовить образец крови и само приспособление. Для этого выполняются следующий пункты:

• разведение биологической жидкости раствором уксусной кислоты с метиленовым синим в пропорции 1:20;
• стекло протирают спиртом и сухой марлевой салфеткой до появления специфических колец, при этом важно не повредить поверхность;
• пустое стекло предварительно просматривают под микроскопом, чтобы предотвратить попадание инородных предметов;
• полученную разведенную кровь добавляют на углубление камеры с помощью стеклянной палочки;
• жидкость должна распределится равномерно, для этого выжидают 1-2 минуты после ее нанесения;
• на предметное стекло направляют микроскоп, подсчитывают все лейкоциты;
• полученную цифру вставляют в формулу, которая подсчитывает общее количество лейкоцитов в объёме жидкости.

Внимание! Если в жидкость попал воздух, подсчет лейкоцитов невозможен. Камеру промывают дистиллированной водой, наливают разведенную кровь повторно .

Подсчет лейкоцитов в камере Горяева с уксусной кислотой уничтожает все эритроциты, а метиленовый синий дает окрашивание белых кровяных телец.

При получении данных пациентами или врачом следует учитывать, что метод не является достаточно точным. Лаборант может ошибиться в подсчете, пропустить некоторые клетки. Более информативные данные получают при подсчете лейкоцитов с помощью полуавтоматических анализаторов, которые в точности измеряют число клеток в 1 мл биологической жидкости.

Формула для подсчета количества лейкоцитов в камере Горяева

Подсчет клеток осуществляет, учитывая что кровь разводилась в 20 раз, клетки считались в 100 квадратах. Поэтому используют следующую формулу:

L=(a×250×20)×10 6 /100

• L - обозначение лейкоцитов, которые необходимо рассчитать;
• a - количество подсчитанных лейкоцитов;
• 250 - число, при умножении на которое получается количество клеток на 1 мкл крови, так как объём большого квадрата составляет 1/250 мкл;
• 20 - разведение материала при подсчете лейкоцитов в камере Горяева;
• 100 - число больших квадратов;
• 10 6 - число мкл в 1 квадрате.

Норма лейкоцитов в крови и отклонения

По формуле выводится количество лейкоцитов на 1 литр крови. У здорового человека это число составляет 4-9×10 9 /л. Показатели могут варьировать в норме, слега выходя за пределы значений, в зависимости от следующих факторов:

• возраст;
• прием пищи;
• время суток;
• состояние организма.

Если после подсчета формулы, показатель резко возрастает или снижается, исследования проводят повторно. После подтверждения результата бланк анализа передают пациенту или врачу.

Повышение лейкоцитов происходит при:

• инфекционных, вирусных, грибковых заболеваниях (это означает, что организм борется с болезнью);
• злокачественных и доброкачественных новообразованиях, которые приводят к резкому увеличению количества форменных элементов крови.

Снижение количества лейкоцитов появляется при нарушениях иммунной системы. Возможны следующие состояния:

• врожденный или приобретенный иммунодефицит;
• патологические состояния красного костного мозга, приводящие к снижению продукции форменных элементов крови.

Методика подсчета лейкоцитов в моче в камере Горяева

С помощью камеры Горяева исследуется осадок урины. Для этого биологическую жидкость оставляют на некоторое время в пробирке. Форменные элементы, другие вещества осаждаются на дно пробирки. С помощью стеклянной палочки берётся небольшое количество мочи с осадком, добавляется в полость камеры.

Дальнейшие подсчеты аналогичны методу исследования крови. Определяется количество клеток в 100 квадратах, полученный результат подставляется в формулу.

Методика подсчета лейкоцитов в моче с помощью камеры Горяева является недостаточно точной, так как возможны следующие нарушения:

• ошибка в подсчете;
• забор недостаточного количества осадка;
• нахождение большего количества лейкоцитов в другой части мочи.

• солей;
• грибов;
• бактерий.

Полуавтоматический анализатор выявляет только заданный параметр.

Норма лейкоцитов в моче и отклонения

В норме лейкоциты не должны находиться в урине. Возможно незначительное их количество, которое отличается по полу:

• 3 клеток у мужчин;
• 5 клеток у женщин.

Если количество показателей повышено, это означает, что образовался воспалительный процесс в одном из отделов мочевыделительного пути.

Камера Горяева - устройство, которое используется в медицинских учреждениях. Метод не даёт стопроцентной гарантии полученных результатов. Но врач может с помощью микроскопа найти другие клетки или образования, которые помогут поставить диагноз.

Екатерина Беликова, врач лабораторной диагностики, специально для сайт

Пример подсчета лейкоцитов в камере Горяева на видео

Лейкоциты. Норма – (4–9)х109/л крови. Их количество зависит от скорости образования в лимфатических узлах, селезенке и костном мозге, мобилизации из костного мозга, утилизации и миграции в ткани, захвата легкими и селезенкой, физиологических факторов. Основная функ­ция гранулоцитов (прежде всего нейтрофильных) фагоцитарная – захват и переваривание с помощью гидролитических ферментов чужеродного материала. При оценке количества лейкоцитов в клинике используется лейкоцитарная формула – процентное соотношение отдельных форм лейкоцитов. В норме эта величина постоянная.

Лейкоцитарная формула

Повышение числа лейкоцитов до нескольких десятков тысяч свидетельствует о лейкоцитозе и наблюдается при острых воспалительных и инфекционных заболеваниях, сопровождается сдвигом лейкоцитарной формулы влево. Повышение числа лейкоцитов до нескольких сотен тысяч указывает на лейкоз. При тяжелых инфекционных заболеваниях изменяется морфология нейтрофилов: отмечаются дегрануляция, вакуолизация и т. д. Уменьшение числа лейкоцитов ниже 4000 указывает на лейкопению , чаще агранулоцитоз. Уменьшение числа белых кровяных телец может быть связано с применением различных лекарств, повышенным радиоактивным фоном, урбанизацией и др. Нейтропения проявляется под влиянием цитостатиков, при вол­чанке, ревматоидном артрите, малярии, сальмонеллезе, бруцеллезе, как специфический синдром – при СПИДе и облучении.

Лейкоциты нейтрофильные. Содержание в крови – 50–75% (2,2–4,2)х109/л. Диаметр –10–12 мкм.

Ядро компактное, состоит из 3–4 сегментов, соединенных мостиками; цитоплазма с обильной зернистостью. При инфекциях и воспалениях ней­трофилы выполняют функцию макрофагов – клеток, способных к фагоцитозу.

Лейкоциты эозинофильные . Норма – 1–5% лейкоцитов, (0,1–0,3)х109/л. Клет­­ки крупнее нейтрофилов, диаметр до 12 мкм. Ядро состоит чаще из 2–3 сег­ментов. Цитоплазма слегка базофильная, содержит крупную, ярко окрашивающуюся эозином зернистость, дающую положительную оксидазную, пероксидазную, цитохромоксидазную, сукцинатдегидрогеназную, кислофосфатазную реакции. Способны к фагоцитозу, принимают участие в дезинтоксикации продуктов белковой природы и аллергических реак­циях организма.Эозинофилия характерна для гельминтозов, возможна на стадии выздоровления при инфекционных заболеваниях.

Лейкоциты базофильные. Содержание в крови – 0–1% (до 0,06х109/л). Диаметр от 8 до 12 мкм. Ядро широкое, неправильной формы. Цитоплазма содержит крупную зернистость, окрашивающуюся мета­хроматически в фиолетово-черные тона. Участвуют в аллергических реакциях (немедленного и замедленного типов): продуцируют гистамин и гепарин (группа гепариноцитов).

Моноциты/макрофаги. Норма – 2–10% лейкоцитов, (0,2–0,55)х109/л. Размеры от 12 до 20 мкм. Ядро крупное, рыхлое, с неравномерным распределением хроматина. В крови циркулируют недолго, переходят в ткани, трансформируясь в макрофаги, способны к амебовидному движению. Ведущие клетки иммунного ответа организма. Основная функция – эндоцитоз. Являются центральным звеном мононуклеарной фагоцитарной системы. Выполняют ряд цитокинзависимых функций: гемопоэтическую, иммуностимулирующую, провоспалительную, иммуносупрессивную и противовоспалительную.

Продукты секреции макрофагов:

Протеазы: активатор плазминогена, коллагеназа, эластаза, ангио­тензинконвертаза.

Медиаторы воспаления и иммуномодуляции: интерлейкин-1 (ИЛ-1), фактор некроза опухоли α, интерферон γ, лизоцим, фактор активации ней­трофилов, компоненты комплемента С1, С2, С3, С5, пропердин, факторы В, Д, ИЛ-3, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-15.

Факторы роста: КСФ-ГМ, КСФ-Г, КСФ-М, фактор роста фибробластов, трансформирующий фактор роста.

Фактор свертывающей системы и ингибиторы фибринолиза: V, VII, IX, X, ингибиторы плазминогена, ингибиторы плазмина.

Адгезивные вещества: фибронектин, тромбоспондин, протеогликаны.

Метод подсчета в камере

Взятие и разведение крови производят пробирочным методом. В пробирку (лучше видалевскую) вносят 0,4 мл разводящей жидкости и 0,02 мл капиллярной крови. Полученное разведение практически считается равным 1: 20. В качестве разводящей жидкости обычно употребляют 3-5%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенной метиленовым синим (уксусная кислота лизирует эритроциты, метиленовый синий окрашивает ядра лейкоцитов). Перед заполнением камеры Горяева пробирку с разведенной кровью тщательно встряхивают. Камеру заполняют так же, как для подсчета эритроцитов.

Лейкоцитов гораздо меньше, чем эритроцитов (1-2 на большой квадрат), поэтому для точности подсчет производят в 100 больших квадратах (неразграфленных).

Расчет: в 100 больших квадратах (1600 малых) сосчитано а лейкоцитов. Помня, что объем малого квадрата равен 1/4000 мм 3 , а кровь разведена в 20 раз, рассчитывают количество лейкоцитов в 1 мкл крови: 4000*20 и делят на 1600 = а*1/2. Практически для получения действительного содержания лейкоцитов в 1 мкл крови достаточно полученное при подсчете число разделить пополам и приписать 2 нуля. В среднем ошибка метода составляет ± 7%.

Более точным (ошибка 2-3%) и совершенным является подсчет лейкоцитов с помощью электронных аппаратов. Подсчет лейкоцитов в счетчиках частиц производят по тому же принципу, что и эритроцитов. Предварительно кровь разводят и смешивают с каким-либо лизирующим эритроциты реактивом. В автоанализаторе «Техникон» в качестве такового применяют раствор уксусной кислоты, в аппаратах «Культер» и «Целлоскоп» - сапонин или сапоглобин, которые добавляют разведенными (1: 500, 1: 700) в изотоническом растворе хлорида натрия (6 капель на 20 мл разведения).

12. Функции Гранулоцитов. Роль Т- и В- лимфоцитов в создании специфических механизмов иммунитета:

Главными клетками иммунной системы являются Т- и В-лимфоциты, которые циркулируют в системе кровотока и лимфотока, постоянно перемещаясь из одних органов иммунной системы в другие, обладают способностью выходить в ткани для выполнения защитных функций (рис.1).

В защитных реакциях специфического иммунитета кроме Т- и В-лим-фоцитов участвуют фагоцитирующие клетки (гранулоциты, моноциты, макрофаги), «естественные киллеры», тучные клетки, эндотелиальные и эпителиальные клетки, которые играют роль вспомогательных, взаимодействуя с Т- и В-лимфоцитами.

Иммунный ответ состоит из сложного ряда клеточных взаимодействий, активируемых попаданием в организм чужеродного антигенного материала. Сначала макрофаг захватывает несущий антигены организм. Затем макрофаг отщепляет часть антигена (пептид) и выводит его на свою поверхность, как бы предъявляя иммунным клеткам. Активация лимфоцита антигеном приводит к пролиферации и трансформации лимфоцитов.

Лимфоциты - это единственные клетки организма, способные специфически распознавать собственные и чужеродные антигены и отвечать активацией на контакт с конкретным антигеном. При весьма сходной морфологии лимфоциты делятся на две популяции, имеющие различные функции и продуцирующие разные белки.

Одна из популяций получила название В-лимфоциты. У человека В-лимфоциты созревают в костном мозге. В-лимфоциты распознают антигены специфическими рецепторами иммуноглобулиновой природы, которые по мере созревания В-лимфоцитов появляются на их мембранах. В-лимфоциты, способны распознавать и связывать белковые, полисахаридные и липопротеидные растворимые антигены.Главной функцией В-лимфоцитов является специфическое распознавание антигена. Узнавание антигена приводит к активации, пролиферации и преобразованию В-лимфоцитов в плазматические клетки - продуценты специфических антител - иммуноглобулинов. Таким образом формируется гуморальный иммунный ответ. Чаще всего В-лимфоциты для развития гуморального иммунного ответа нуждаются в помощи Т-лимфоцитов в виде продукции активирующих цитокинов.

Другая популяция получила название Т-лимфоциты в связи с дифференцировкой их предшественников в тимусе. Т-лимфоциты выполняют важнейшую функцию специфического распознавания и связывания антигена. Активированные антигенами Т-лимфоциты пролиферируют и превращаются в различные субпопуляции, участвующие далее во всех формах иммунного ответа. Активированный Т-лимфоцит так же продуцирует и выделяет цитокины, усиливающие процессы увеличения количества самих Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и макрофагов.

Среди зрелых Т-лимфоцитов различают две основные субпопуляции: Т-хелперы (CD4+) и Т- киллеры - цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+). Маркировка «CD» является характеристикой «поверхностного фенотипа клетки» - «кластер дифференцировки» (от английского clusters of differentiation - CD).

Имеется еще один тип лимфоцитов - большие гранулярные лимфоциты, отличающиеся от меньших по величине Т- и В-лимфоцитов не только особенностями структуры, но и отсутствием антигенраспознающего рецептора. Эти клетки получили название «естественные киллеры» : они способны убивать инфицированные разными вирусами клетки-мишени или опухолевые клетки (см. табл. 1).

Таблица 1. Классификация лимфоцитов человека

Т-клетки разрушающе действуют на следующие объекты:

1. Злокачественные клетки.

2. Клетки, инфицированные микроорганизмами.

3. Трансплантированные органы и ткани.

В атаке участвует вся клетка, поэтому ответ называется клеточным иммунитетом.

Таким образом, существует два главных типа иммунного ответа:

· Клеточный иммунитет это функция T-лимфоцитов.

· Гуморальный иммунитет – с участием В-лимфоцитов.

Существует еще одна субпопуляция Т-лимфоцитов: регуляторные Т-лимфоциты, Т-регуляторные клетки Тreg), Т-супрессоры - центральные регуляторы иммунного ответа. Основная их функция - контролировать силу и продолжительность иммунного ответа через регуляцию функции Т-эффекторных клеткок (Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток).

Рис. 2. Общая схема иммунного ответа

Феномен супрессии иммунного ответа был известен давно, но не были известны его механизмы. Поэтому было предположено существование специфических клеток Т-супрессоров, однако существование этих клеток долгое время не было подтверждено экспериментально. Лишь в конце 1990-х и в начале 2000-х годов было показано существование определенных Т-клеток, которые характеризовались фенотипом CD25+FOXP3+ и эффективно подавляли иммунный ответ.

13. иммунитет, его неспецифические и специфические механизмы:

Адаптивный (устар. приобретённый, специфический) иммунитет имеет способность распознавать и реагировать на индивидуальные антигены, характеризуется клональным ответом, в реакцию вовлекаются лимфоидные клетки, имеется иммунологическая память, возможна аутоагрессия.

Классифицируют на активный и пассивный.

• Приобретённый активный иммунитет возникает после перенесённого заболевания или после введения вакцины.
• Приобретённый пассивный иммунитет развивается при введении в организм готовых антител в виде сыворотки или передаче их новорождённому с молозивом матери или внутриутробным способом.

Другая классификация разделяет иммунитет на естественный и искусственный.

• Естественный иммунитет включает врождённый иммунитет и приобретённый активный (после перенесённого заболевания), а также пассивный иммунитет при передаче антител ребёнку от матери.
• Искусственный иммунитет включает приобретённый активный после прививки (введение вакцины) и приобретённый пассивный (введение сыворотки).

Врождённый (неспецифический) иммунитет обусловлен способностью идентифицировать и обезвреживать разнообразные патогены по наиболее консервативным, общим для них признакам, дальности эволюционного родства, до первой встречи с ними. В 2011 году была вручена Нобелевская премия в области медицины и физиологии за изучение новых механизмов работы врождённого иммунитета (Ральф Стайнман, Жюль Хоффман и Брюс Бётлер).

Осуществляется большей частью клетками миелоидного ряда, не имеет строгой специфичности к антигенам, не имеет клонального ответа, не обладаетпамятью о первичном контакте с чужеродным агентом.

14. Мононуклеарно-фагоцитарная система:

Система мононуклеарных фагоцитов (греч. monox один + лат. nucleos ядро: греч. рhagos пожирающий, поглощающий + гистол. суtus клетка; синоним: макрофагальная система, моноцитарно-макрофагальная система) - физиологическая защитная система клеток, обладающих способностью поглощать и переваривать чужеродный материал. Клетки, входящие в состав этой системы, имеют общее происхождение, характеризуются морфологическим и функциональным сходством и присутствуют во всех тканях организма.

Основой современного представления о cистема мононуклеарных фагоцитов является фагоцитарная теория, разработанная И.И. Мечниковым в конце 19 в., и учение немецкого патолога Ашоффа (К. А.L. Aschoff) о ретикулоэндотелиальной системе (РЭС). Первоначально РЭС была выделена морфологически как система клеток организма, способных накапливать витальный краситель кармин. По этому признаку к РЭС были отнесены гистиоциты соединительной ткани, моноциты крови, клетки Купфера печени, а также ретикулярные клетки кроветворных органов, эндотелиальные клетки капилляров, синусов костного мозга и лимфатического узлов. По мере накопления новых знаний и совершенствования морфологических методов исследования стало ясно, что представления о ретикулоэндотелиальной системе расплывчаты, не конкретны, а в ряде положений просто ошибочны. Так, например, ретикулярным клеткам и эндотелию синусов костного мозга и лимфатических узлов длительное время приписывалась роль источника фагоцитирующих клеток, что оказалось неверным.

В настоящее время установлено, что мононуклеарные фагоциты происходят из циркулирующих моноцитов крови. Моноциты созревают в костном мозге, затем поступают в кровяное русло, откуда мигрируют в ткани и серозные полости, становясь макрофагами. Ретикулярные клетки выполняют опорную функцию и создают так называемое микроокружение для кроветворных и лимфоидных клеток. Эндотелиальные клетки осуществляют транспорт веществ через стенки капилляров. Непосредственного отношения к защитной системе клеток ретикулярные клетки и эндотелий сосудов не имеют. В 1969 г. на конференции в Лейдене, посвященной проблеме РЭС, понятие «ретикулоэндотелиальная система» было признано устаревшим. Вместо него принято понятие «система мононуклеарных фагоцитов». К этой системе относят гистиоциты соединительной ткани, клетки Купфера печени (звездчатые ретикулоэндотелиоциты), альвеолярные макрофаги легких, макрофаги лимфатических узлов, селезенки, костного мозга, плевральные и перитонеальные макрофаги, остеокласты костной ткани, микроглию нервной ткани, синовиоциты синовиальных оболочек, клетки Лангергаиса кожи, беспигментные гранулярные дендроциты. Различают свободные, т.е. перемещающиеся по тканям, и фиксированные (резидентные) макрофаги, имеющие относительно постоянное место.

Макрофаги тканей и серозных полостей, по данным сканирующей электронной микроскопии, имеют форму, близкую к сферической, с неровной складчатой поверхностью, образованной плазматической мембраной (цитолеммой). В условиях культивирования макрофаги распластываются на поверхности субстрата и приобретают уплощенную форму, а при перемещении образуют множественные полиморфные псевдоподии.

Характерным ультраструктурным признаком макрофага служит наличие в его цитоплазме многочисленных лизосом и фаголизосом, или пищеварительных вакуолей. Лизосомы содержат различные гидролитические ферменты, обеспечивающие переваривание поглощенного материала. Макрофаги - активные секреторные клетки, которые освобождают в окружающую среду ферменты, ингибиторы, компоненты комплемента. Основным секреторным продуктом макрофагов является лизоцим. Активированные макрофаги секретируют нейтральные протеиназы (эластазу, коллагеназу), активаторы плазминогена, факторы комплемента, такие как С2, С3, С4, С5, а также интерферон.

Клетки cистема мононуклеарных фагоцитовобладают рядом функций, в основе которых лежит их способность к эндоцитозу, т.е. поглощению и перевариванию инородных частиц и коллоидных жидкостей. Благодаря этой способности они выполняют защитную функцию. Посредством хемотаксиса макрофаги мигрируют в очаги инфекции и воспаления, где осуществляют фагоцитоз микроорганизмов, их умерщвление и переваривание. В условиях хронического воспаления могут появляться особые формы фагоцитов - эпителиоидные клетки (например, в инфекционной гранулеме) и гигантские многоядерные клетки типа клеток Пирогова - Лангханса и типа клеток инородных тел. которые образуются путем слияния отдельных фагоцитов в поликарион - многоядерную клетку. В гранулемах макрофаги вырабатывают гликопротеид фибронектин, который привлекает фибробласгы и способствует развитию склероза.

Клетки cистема мононуклеарных фагоцитов принимают участие в иммунных процессах.

Так, непременным условием развития направленного иммунного ответа является первичное взаимодействие макрофага с антигеном. При этом антиген поглощается и перерабатывается макрофагом в иммуногенную форму. Иммунная стимуляция лимфоцитов происходит при непосредственном контакте их с макрофагом, несущим преобразованный антиген. Имунный ответ в целом осуществляется как сложное многоэтапное взаимодействие Г- и В-лимфоцитов с макрофагами.

Макрофаги обладают противоопухолевой активностью и проявляют цитотоксические свойства в отношении опухолевых клеток. Эта активность особенно выражена у так называемых иммунных макрофагов, осуществляющих лизис опухолевых клеток-мишеней при контакте с сенсибилизированными Т-лимфоцитами, несущими цитофильные антитела (лимфокины).

Клетки cистема мононуклеарных фагоцитов принимают участие в регуляции миелоидного и лимфоидного кроветворения. Так, островки кроветворения в красном костном мозге, селезенке, печени и желточном мешке эмбрионе формируются вокруг особой клетки - центрального макрофага, организующего эритропоэз эритробластического островка. Клетки Купфера печени участвуют в регуляции кроветворения путем выработки эритропоэтина. Моноциты и макрофаги вырабатывают факторы, стимулирующие продукцию моноцитов, нейтрофилов и эозинофилов. В вилочковой железе (тимусе) и тимусзависимых зонах лимфоидных органов обнаружены так называемые интердигитирующие клетки - специфические стромальные элементы, также относящиеся к cистемs мононуклеарных фагоцитов, ответственные за миграцию и дифференцировку лимфоцитов.

Обменная функция макрофагов заключается в их участии в обмене железа.

В селезенке и костном мозге макрофаги осуществляют эритрофагоцитоз, при этом в них происходит накопление железа в форме гемосидерина и ферритина, которое питом может реутилизироваться эритробластами.

15. Лейкоцито и его виды. Лейкопения:

Лейкоцитарная формула - это процентное соотношение отдельных видов лейкоцитов в периферической крови. Лейкоцитарная формула видоизменяется определенным образом, типично для каждого определенного заболевания. Лейкоциты при различных заболеваниях, чаще при инфекциях, изменяются в количественном отношении.

Повышение числа лейкоцитов - лейкоцитоз, снижение - лейкопения.

Лейкоцитоз может быть физиологическим и патологическим, первый возникает у здоровых людей, второй - при каких-то болезненных состояниях. Лейкоцитоз - изменение клеточного состава крови, характеризующееся повышением числа лейкоцитов. Норма лейкоцитов в крови - 3,5 - 8,8?109/л, но этот показатель может отличаться в большую или меньшую сторону, в зависимости от лаборатории и используемых методов.

Лейкоцитоз может быть физиологическим и патологическим, первый возникает у здоровых людей, второй - при каких-то болезненных состояниях. К физиологическому относят алиментарный лейкоцитоз (после приема пищи), миогенный (после физического напряжения), лейкоцитоз беременных и др. Патологический лейкоцитоз обусловлен реакцией кроветворных органов на раздражение, вызванное инфекционными, токсическими, гнойно-воспалительными, лучевыми и другими агентами. Он наблюдается также при некрозе ткани (инфаркт миокарда, распад опухоли), после больших кровотечений, ранений, черепно-мозговых травм и др. Как правило, лейкоцитоз исчезает вместе с вызвавшей его причиной. Преходящий лейкоцитоз, характеризующийся появлением в крови незрелых лейкоцитов, называют лейкемоидной реакцией.

Лейкопения - уменьшение числа лейкоцитов в крови при некоторых инфекционных и других заболеваниях, а также в результате лучевого поражения, приема лекарственных препаратов или рефлекторных воздействий на костный мозг.

К лейкопении приводят лучевое поражение, контакт с рядом химических веществ (бензол, мышьяк, ДДТ и др.); прием медикаментозных препаратов (цитостатические средства, некоторые виды антибиотиков, сульфаниламидов и др.). Лейкопения возникает при вирусных и тяжело протекающих бактериальных инфекциях, заболеваниях системы крови.

При лейкопении необходимо точно выяснить причину заболевания. Наряду с вирусными инфекциями и заболеваниями кроветворящих органов причиной лейкопении может стать побочное действие аллопатических препаратов, так как ряд препаратов оказывает токсическое действие на костный мозг и может посредством аллергических механизмов вызывать лейкопению и агранулоцитоз.

Лечение заключается в назначении препаратов, стимулирующих развитие новых лейкоцитов или стимулирующих выброс созревающих лейкоцитов.

16. Регуляция лейкопоэза:

Регуляция лейкопоэза. Продукция лейкоцитов стимулируется лейкопоэтинами, появляющимися после быстрого удаления из крови большого количества лейкоцитов. Химическая природа и место образования в организме лейкопоэтинов еще не изучены. На лейкопоэз оказывают стимулирующее влияние нуклеиновые кислоты, продукты распада тканей, возникающие при их повреждении и воспалении, и некоторые гормоны. Так, под действием гормонов гипофиза - адренокортикотропного гормона и гормона роста - повышается количество нейтрофилов и уменьшается число эозинофилов в крови.

В стимуляции лейкопоэза большую роль играет нервная система. Раздражение симпатических нервов вызывает увеличение нейтрофильных лейкоцитов в крови. Длительное раздражение блуждающего нерва вызывает перераспределение лейкоцитов в крови: их содержание нарастает в крови мезентериальных сосудов и убывает в крови периферических сосудов; раздражение и эмоциональное возбуждение увеличивают количество лейкоцитов в крови. После еды увеличивается содержание лейкоцитов в крови, циркулирующей в сосудах. В этих условиях, а также при мышечной работе и болевых раздражениях в кровь поступают лейкоциты, находящиеся в селезенке и синусах костного мозга.

Оборудование: микроскоп, камера Горяева, пипетка, капилляр от гемометра Сали, пробирка с резиновой крышкой.

Реагенты: жидкость Тюрка (100 мл 5%-го р-ра уксусной к-ты и 1 мл 1%-го р-ра генциан фиолетового или метиленового синего), спирт, иммерсионное масло.

Камера Горяева – толстое предметное стекло с четырьмя желобами в средней части, между которыми находятся три узкие площадки, средняя из которых ниже боковых на 0,1 мм и разделена пополам поперечным желобком. По обе стороны от этого желобка расположены сетки, нанесенные на стекло. Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, из которых 25 расчерчены вертикальными и горизонтальными линиями на 16 малых квадратов. Подсчет лейкоцитов ведут в счетной камере Горяева под малым увеличением микроскопа в 100 неразграфленных больших квадратах. Большой квадрат равен 16 малым, что соответствует 100 х 16 = 1600 малым квадратам. Единицей отсчета является маленький квадрат. Его сторона равна 1/20 мм, площадь 1/20*1/20=1/400 мм 2 . Объем крови, помещающейся над маленьким квадратом, равен 1/400 мм 2 *1/10 мм=1/4000 мм 3 (1/10 мм – высота слоя крови). из 225 больших квадратов

Ход работы. Покровное стекло притереть к камере Горяева до появления радужных колец.

Установить увеличение микроскопа в 280 раз (окуляр на 7, объектив на 40). Поставить камеру на предметный столик микроскопа, найти сетки, рассмотреть.

Пипеткой взять 0,4 мл жидкости Тюрка (5%-ый раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим) и влить в пробирку.

Набрать кровь в капилляр от гемометра Сали до отметки (0,02 мл); кончик капилляра вытереть ватой; опустить капилляр в пробирку с жидкостью Тюрка; выдуть кровь в пробирку; промыть капилляр, дважды выдувая этот раствор разбавителя. Пробирку закрыть резиновой пробкой, перемешать содержимое. Набрать содержимое пробирки в капилляр. Каплю из капилляра выпустить на среднюю пластинку под притертое покровное стекло к камере Горяева (пузырьки воздуха не должны попасть под покровное стекло). Оставить на 1 мин., чтобы осели клетки крови.

Подсчитать количество лейкоцитов в 100 больших квадратах (или 1600 малых квадратах). Учитывают клетки, находящиеся внутри каждого малого квадрата, на левых и верхних сторонах каждого квадратика. Не считают на нижних и правых сторонах квадрата, т.к. их число учитывается при подсчете лейкоцитов следующего квадрата.

Х=(А*4000*20)/1600, где

А – количество лейкоцитов в 100 больших квадратах,

4000 – коэффициент для приведения объема к 1 мм 3 (1/4000 мм 3 – объем одного маленького квадрата),

20 – коэффициент разведения крови объемом 0,02 мл,

1600 – количество маленьких квадратов.

Практически для получения действительного содержания лейкоцитов в 1 мкл крови достаточно полученное при подсчете число разделить пополам и приписать 2 нуля (или подсчитанное число клеток крови разделить на 50), ошибка метода составляет ± 7%.

Например, подсчитано 160 лейкоцитов, тогда в абсолютных единицах получаем 8 000 клеток в 1 мкл крови. Для пересчета количества клеток в 1 л (система единиц СИ) необходимо результат умножить на 10 6 , т.е. 8 000*10 6 = 9*10 9 /л.

Оформление работы. Записать или зарисовать последовательность счета клеток в камере Горяева. Подсчитать количество клеток, записать.

Работа 5. Приготовление мазков крови , окрашивание по Романовскому-Гимзе

Оборудование: обезжиренные предметные и шлифовальные стекла, вата, пинцет, пипетка на 10 мл, глазные пипетки, ванночки размером с предметное стекло, карандаш.

Реагенты: кровь рыбы, 70 % этиловый спирт,

В основе методики лежит способность смеси основных (азур II) и кислых красителей (водорастворимый желтый эозин) окрашивать элементы клеток крови в разные цвета и оттенки. Окрашиватся ацидофильные образования в различные оттенки красного цвета, базофильные - в цвета от пурпурного до синего.

Ход работы. Обезжирить предметные стекла

Предметное стекло взять в левую руку между большим и указательным пальцами за короткие грани.

Каплю крови (величиной с зерном пшена) нанести на правый конец стекла (предметным стеклом, углом шлифовального стекла, пипеткой). Капля должна быть такого размера, чтобы конец мазка, приготовленного из нее, не доходил на 1 см до края стекла.

Шлифовальное стекло ставят под углом 45º к основному стеклу у правого края предметного стекла, надвигают на каплю крови так, чтобы у нижнего ребра шлифовального стекла равномерно распределилась капля крови. Распределяют справа налево каплю крови по предметному стеклу равномерно, быстро. Мазок должен быть тонким, ровным, желтоватым, просвечивающимся и отливать должен цветами радуги при просмотре на свет.

А – неравномерный мазок на плохо обезжиренном стекле; Б – короткий мазок; В – длинный и неравномерный мазок; Г – толстый в начале мазок; Д – правильный мазок.

Рисунок 2. Качество приготовленного мазка.

Высушить мазок быстро (под лампой, в термостате, высоко над спиртовкой).

Промаркировать простым карандашом.

Фиксировать в закрытой кювете в этиловом спирте 5 мин., высушить на воздухе.

На дно ч.Петри налить готовую краску Романовского, препарат уложить мазком вниз в краску, закрыть крышкой от ч.Петри (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). Мазки окрашивать 20 - 25 минут во влажной камере в термостате при 37 °C.

После окрашивания мазки промыть в проточной воде, сушить на воздухе и исследовать при масляной иммерсии.

Оформление работы. Записать последовательность методики окрашивания.

Факторы, влияющие на правильность исследования лейкоцитов

Криоглобулинемия

Парапротеинемия

Нормобласты

Агрегаты тромбоцитов

Нелизированные эритроциты

Длительное хранение крови при комнатной температуре

Возраст Количество лейкоцитов

1 день 11.6 - 22.0

1 неделя 8.1.- 14.3

1 месяц 7.6 - 12.4

1 год 6.8 - 11.0

Взрослые 4.0 - 9.0

Методы определения количества лейкоцитов в крови .

- Подсчет количества лейкоцитов в счетной камере

- Подсчет лейкоцитов в гематологических анализаторах

Определение количества лейкоцитов в счетной камере.

Подсчет лейкоцитов под микроскопом проводят после лизирования эритроцитов в 100 больших квадратах счетной сетки и пересчитывают на 1 л крови, исходя из объема квадратов и разведения крови. Подсчет лейкоцитов должен быть произведен в течение 2-4 ч после взятия крови.

- При наличии в периферической крови ядросодержащих клеток красного ряд, они не лизируются и подсчитываются вместе с лейкоцитами. В этом случае, чтобы определить истинное количество лейкоцитов, из общего числа посчитанных клеток вычитают количество клеток красного ряда.

- Например: Общее количество лейкоцитов при подсчете в камере (или на анализаторе) -45х109/л. При подсчете лейкоцитарной формулы найдено, что на 100 лейкоцитов присутствует 50 эритробластов (нормобластов).

Рассчитываем истинное количество лейкоцитов в крови:

150 клеток - 45 х 109/л

100 клеток (лейкоциты) - X

Х =100*45*10/л /150 = 30*10/л

Таким образом, истинное число лейкоцитов в крови составляет 30 х109/л.

Основные источники ошибок при подсчете лейкоцитов в камере:

Неправильное соотношение объемов крови и уксусной кислоты, взятых в пробирку.

Неправильно подготовленный раствор уксусной кислоты (при концентрации большей, чем 5%, часть лейкоцитов может лизироваться, что приведет к занижению результата).

Длительное нахождение пробы при температуре выше 28°С, что может ускорить лизис лейкоцитов в образце и привести к занижению результата.

Неправильное заполнение камеры Горяева. Как и при подсчете эритроцитов, камеру необходимо оставлять на 1 минуту для оседания клеток.

Недостаточно хорошо отмытая после предыдущего определения камера Горяева. Оставшиеся в камере лейкоциты могут завышать результаты анализа.

Методы подсчета тромбоцитов

В счетной камере

Мазках крови

Гематологическом анализаторе

Каждая группа методов имеет преимущества и недостатки.

Подсчет тромбоцитов в камере достаточно точен, не требует для расчета количества эритроцитов. С другой стороны этот метод более трудоемкий, поскольку тромбоциты в нативном виде представлены мелкими и плохо контрастированными элементами. Недостаток метода - подсчет тромбоцитов в ближайшие часы после взятия крови.

Определение количества тромбоцитов в мазках крови значительно уступает по своей точности камерному методу или автоматическим счетчикам. Ошибки при подсчете в мазках крови могут быть обусловлены плохим качеством мазка и связанным с этим неравномерным распределением тромбоцитов, неточным определением количества эритроцитов крови. Существенное неудобство метода - необходимость одновременного подсчета тромбоцитов и эритроцитов в крови. Преимущество его - возможность исследования тромбоцитов в любое время, независимо от момента взятия крови.

Метод определения тромбоцитов с помощью гематологического анализатора позволяет достаточно точно определить количество тромбоцитов, их средний объем и распределение по объему.